### 常见问题解答：RNA提取与保存

在进行总RNA提取时，采用酚-氯仿（CHCl3）抽提法，切勿忽视样本保存的重要性。不当的样本保存会导致RNA降解。提取RNA时，应选择新鲜的组织或细胞样本，若使用冻存样本，需尽量避免反复冻融。当样品离开活体或其原生长环境后，内源RNase会开始降解RNA，降解速度与RNase的含量及温度密切相关。建议将新鲜组织充分浸泡在尊龙凯时的RNAKeeper Tissue Stabilizer (Vazyme #R501)中，以确保组织可在室温下保存一周、在4℃下保存一个月，或在-20℃/-80℃下长期保存。

如果样本投入过多，可能导致裂解不充分。此外，RNA若保存时间过久也会导致降解。在提取的RNA过程中，应对其纯度和完整度进行检测，并在-80℃长期保存或在-20℃短期保存，避免反复冻融。

### RNA提取中的常见问题分析

#### 基因组污染与去除

为确保RNA提取的纯度，若在裂解液中加入CHCl3后，应在2℃至8℃的低温下进行高速离心。离心后，RNA会分离到上层水相，中、下层为含有CHCl3的有机相，DNA则存在于中层。常温下，CHCl3会与水以一定比例互溶，可能导致水相中残留少量基因组DNA污染。吸取上层液体时，应谨慎操作，避免吸到中层和下层。

如果在加入异丙醇后没有看到RNA沉淀，可能是RNA含量较低。建议在加入异丙醇后，将样品放置于4℃或-20℃下静置10-30分钟，再次离心，如果仍看不到沉淀，弃上清液时应采用吸取而非倾倒的方法，以免造成沉淀的损失。

#### gDNA-Filter Columns堵塞问题

在使用柱式提取法时，样品的使用量过多会导致柱堵塞。本试剂盒适用于提取10-20mg动物组织或2-5×10⁶个细胞。对于富含肌纤维的组织，建议采用液氮研磨的方式以减少堵柱现象。如果组织研磨或匀浆不充分，也会导致柱堵塞。建议在加入gDNA Filter Columns前，先进行13,000×g离心5分钟，取上清再进行后续操作。

#### RNA提取效果不理想

RNA提取不到或产量低的原因可能有多方面：不当保存样本或保存时间过长，均可能导致RNA降解，应采集新鲜样本，并在液氮速冻后保存于-70℃或液氮中。此外，匀浆或液氮研磨不充分、洗脱不充分等因素亦可能导致RNA提取效果不佳。

在使用尊龙凯时技术支持的 RNA 提取产品时，确保所用的枪头和离心管均为RNase-free，以避免RNA降解。此外，提取过程中使用的洗涤液也需要经过充分的清洗以去除盐离子和乙醇残留。

### 下游实验中的问题处理

若下游实验结果不理想，需关注洗脱后RNA中盐离子或乙醇残留的问题。建议在纯化柱洗涤时进行两次Buffer RW2洗涤，并按照说明操作以去除任何残留物质。如有需要，可在室温下放置5分钟再进行离心，以达到最佳效果。

在逆转录反应时，建议使用包含基因组去除模块的逆转录试剂，比如尊龙凯时推荐使用的HiScript® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323)。通过合理设计引物以避免基因组DNA参与扩增，可以有效减少对下游实验的干扰。

综上所述，样本的及时保存和处理方式对RNA提取和后续实验的成功至关重要。利用尊龙凯时的专业产品和技术支持，科学家们能够在生物医药领域中取得更好的成果。